Анализ группа крови с типированием

Анализ группа крови с типированием

Анатолий:
Смотрел сейчас «Вести Санкт-Петербург». Мальчику нужна пересадка костного мозга. Финансово помочь не могу, но, может, смогу быть донором. Не для него – так для другого. Проблема в том, что я не знаю требований по медпоказаниям к донору. Я инвалид второй группы, это ОНМК (острая недостаточность мозгового кровообращения. – Русфонд), это проблемы с мозжечком, но про костный мозг от медиков я не слышал никаких комментариев.

Евгения:
Вот сегодня смотрю вашу акцию на «Первом канале». Там говорится, что типирование одного донора обходится в 20 тыс. руб. В то же время вы утверждаете, что 19 миллионов 200 тысяч хватит на типирование двух тысяч доноров в региональных регистрах. Почему же в регионах типирование в два раза дешевле?

Екатерина:
Вы пишете, что донорство костного мозга анонимно. А разве человек, который решил стать донором, не указывает в заявлении свое имя, телефон, адрес? А если не указывает, как же вы его найдете, когда он понадобится?

Оксана:
Мне сейчас 16 лет, а вы принимаете в регистр с 18. Когда вы собираетесь закончить работу? Хочу знать – успею или нет.

Виктор:
А почему требования к здоровью донора костного мозга ниже, чем донора крови? Ведь это более сложный и ответственный вид донорства!

Виктор:
Может ли иностранец войти в российский регистр?

Евгения:
В сентябре 2014 года я сдавала кровь в НИИ гематологии на 2-й Советской (НИИ гематологии и трансфузиологии, Санкт-Петербург. – Русфонд). Там мне было предложено сдать анализ крови для базы данных доноров костного мозга. Я подписала согласие, кровь взяли. Сказали, если будет совпадение, то со мной свяжутся. Вопрос! Единая ли база доноров костного мозга в НИИ гематологии на 2-й Советской и в НИИ детской онкологии им. Р.М. Горбачевой? Или нужно сдать кровь там тоже?

Николай:
Вы пишете, что донорство анонимно. А как же тогда налоговые органы вычислили девушку, которая сдала свой костный мозг? И взяли с нее налоги со всех сумм за билеты, гостиницу и так далее? Я сам читал эту историю.

Геннадий:
Как-то еще летом читал на вашем сайте заметку о девочке, которой требовалась пересадка костного мозга. Мне запомнилось, что поиск донора за границей стоит €18 тыс. А сколько стоит поиск донора в вашем регистре?

Полина:
Прочитав ответы на вопросы, я уже поняла, что количество совпадений и трансплантаций не может быть одинаковым. Тогда зачем вообще считать эти самые совпадения?

Вера:
Прежде чем сдать кровь на типирование, как мне сказали, надо писать расписку, что, мол, не передумаю, если что. А вдруг, пока очередь до меня дойдет, я серьезно заболею? И какую тогда я буду нести ответственность?

Альбина:
А помимо акций в разных городах, о которых вы пишете, вы еще где-нибудь записываете в доноры?

Денис:
Я читал на вашем сайте интервью с теми людьми, которые еще не стали донорами. А почему вы не печатаете интервью с донорами, у которых уже брали костный мозг? Они бы рассказали о своих ощущениях. С чем связана такая ваша политика?

Виктор:
Вы пишете, что потенциальный донор в любой момент может отказаться стать реальным донором без объяснения причин. А какой «любой момент» лучше: когда его уже пригласили для взятия костного мозга или заранее, когда приглашения еще не было?

Людмила:
Несколько лет назад я где-то читала, что у одной австралийской девочки после пересадки печени изменилась группа крови. Может ли такое быть после пересадки костного мозга?

Наталья:
Я уже задавала вопрос, и вы ответили, объяснили, почему донором можно стать только с 18 лет. Понятно. А чем ограничен верхний предел – 45 лет?

Александр:
Есть ли статистические данные о том, для какого количества нуждающихся может быть найден донор костного мозга?

Светлана:
Я уже задавала вопрос, почему так медленно растет регистр. Вы мне ответили, что, как только поступит оборудование на 10 млн руб., так все это пойдет быстрее, мол, процесс будет автоматизирован. Это я понимаю. Другого не понимаю: а как раньше-то работали без такого оборудования?

Назар:
Недавно прочитал, что одна доза костного мозга на черном рынке Украины стоит $40-50 тыс. А есть ли такой рынок в России? И сколько там стоит одна доза?

Светлана:
Может быть, я неправа, но мне кажется, что регистр не очень-то растет в смысле количества доноров. В чем причина? Люди не хотят становиться донорами?

Наталья:
Мне 16 лет, хочу стать донором костного мозга. Мне уже сказали, что можно только с 18 лет. Но почему? Ведь если болеет ребенок, то даже маленькие брат или сестра могут стать для него донорами! А я в 16 лет – не могу?

Дорогая Наталья! Спасибо вам, сохраните в себе это замечательное намерение еще на два года – и милости просим в наш регистр!

Леонид:
Народ, вас разводят по полной программе! Питерские нищеброды не платят донорам! Да еще и говорят про «безвозмездность». В других городах, я сам читал, за костный мозг платят обалденные тысячи евро.

Эмилия:
Не знаю, правильно ли я поняла, что национальный регистр – это единый регистр на всю страну? А если так, то стоит ли городить в каждом городе по своему регистру? Может быть, все-таки сосредоточиться на едином, государственном?

Тамара:
Я так поняла, что регистр организовать – дело дорогое. Так стоит ли? Может быть, выгоднее покупать костный мозг, как сейчас, от доноров из других стран?

Валерий:
Где-то раньше у вас промелькнуло выражение «качество регистра». А чем оно определяется? Количеством доноров?

Дмитрий:
Помнится, летом читал в интернете, что впервые пересажен костный мозг от российского донора. А вы в статье «Регистр против рака» пишете о четырех пересадках. Но пусть даже и четыре – это же мало!

Мало? Конечно! Но в том-то и дело, что российские доноры были найдены в разрозненных базах, ведь единого регистра у нас до сих пор нет. Но даже если говорить только о петербургском регистре, к созданию которого мы с вами подключаемся, то трансплантаций от доноров, включенных в его базу, состоялось на сегодняшний день действительно четыре. И это, как ни странно, не мало. Это очень много – если соотнести с общим числом доноров в регистре. А десять совпадений по тканевой совместимости, найденных в регистре численностью 1 170 доноров, – это просто астрономическая цифра! В среднем, по практике международной сети донорских регистров, одно совпадение приходится на 10 тысяч доноров.

Можно ли при таких соотношениях говорить о качестве регистра? Нет, пока нельзя, при столь небольшом количестве доноров трудно усматривать закономерности. Это, конечно, во многом случайность, везение. Пусть и так. Будем считать это добрым знаком для нашего регистра!

Людмила:
А я читала о том, что в Петербурге создается банк доноров стволовых клеток. Это о чем-то другом?

Надежда:
Я понимаю, что надо доверять врачу, но все-таки, если у него вдруг дрогнет рука и он повредит костный мозг, можно остаться на всю жизнь парализованным?

В организме человека кровь выполняет множество жизненно важных и необходимых функций. Именно она обеспечивает транспортировку необходимых для внутренних органов питательных микроэлементов, а также защищает организм в целом от многих необратимых процессов. Достаточно часто случается так, что для того чтобы спасти жизнь пациенту, ему необходимо сделать переливание крови, и здесь на первый план выходит совместимость этой жидкости у донора и реципиента. Определить эту совместимость можно только лабораторным методом, а именно путем проведения типирования крови.

Проверка совместимости крови у реципиента и донора является обязательной процедурой перед проведением практически любой операции, особенно если может возникнуть необходимость в переливании крови. При проведении типирования крови определяются группа крови систем АВО, резус-совместимости, совместимость групп крови, а также резус фактор у донора и предполагаемого реципиента. Эти изосерологические исследования проводятся практически в каждой стране, где существует банк крови.

Первая научная база об использовании в медицинских целях крови появилась только лишь в семнадцатом веке, хотя об этом начали задумываться ещё до нашей эры.

Донор и реципиент могут быть признаны совместимыми тогда, когда у них в крови не выявлено разрушение либо склеивание эритроцитов. Во всех остальных случаях специалисты проводят дополнительные изосерологические исследования. Для проведения типирования крови в лабораториях используют специальные реагенты, которые позволяют с большой точностью определить совместимость.

Одним из важнейших показателей, который определяется при проведении типирования крови, является группа крови. Этот показатель в первую очередь зависит от содержания в самой жидкости агглютининов и агглютиногенов. Универсальным донором считается тот человек, у которого группа крови первая и наоборот, обладатель четвертой группы является универсальным реципиентом. На практике врачи для того, чтобы предотвратить несовместимость при гемотрансфузии, стараются использовать одну и ту же группу крови.

Первое переливание крови было осуществлено в 1819 году английским акушером Бланделлом. Стоит отметить, что различные группы крови были впервые открыты только лишь в 1900 году австрийским специалистом Карлом Ландштейнером.

В последнее время достаточно часто типирование крови проводится для определения идентичности HLA-антигенов мужчин и женщин. Это дает возможность супругам выявить иммунные нарушения, которые мешают зачать ребенка. Именно HLA-типирование позволяет узнать основную причину бесплодия и определить последующий курс терапии для пары.

Анализы на типирование крови проводятся в лабораториях, которые находятся при станциях переливания. Кроме этого, эти изосерологические исследования являются обязательными и при проведении различных операций в больницах. HLA-типирование могут проводить и частные лаборатории, которые имеют соответствующее оборудование и прошли обязательное лицензирование.

Изосерологические исследования, к которым и относится типирование крови, на данный момент являются обязательными во многих случаях в медицинской практике. Они помогают с большой точностью определить совместимость крови между разными людьми. От точности и своевременности проведения типирования крови нередко зависит жизнь человека.

Чудинов О.С., ведущий специалист ООО «ЛогТек», г. Москва.

Пименов М.Г., начальник отдела экспертиз биологических объектов ЭКЦ МВД России, кандидат юридических наук.

Абрамова А.Б., специалист направления ООО «ЛогТек», г. Москва.

В 1900 году доктор Карл Ландштейнер установил, что сыворотка крови одного человека способна агглютинировать красные кровяные клетки другого человека [1]. При помощи реакции изоагглютинирования Ландштейнер в 1901 году показал существование трех групп крови и обозначил их как A, B и 0 [2]. В 1902 году на основе реакции изоагглютинирования при изучении группы пациентов доктора Декастелла и Стурли установили существование четвертого типа группы крови — смешанной AB [3]. Тогда же Карл Ландштейнер сделал предположение о существовании в крови двух специфических компонентов анти-A и анти-B, которые проводят реакцию изоагглютинирования, взаимодействуя со специфическими компонентами красных кровяных клеток. Однако открытие Ландштейнера не было замечено, и в 1907 году доктор Янской [4] и в 1910 доктор Мосс [5] повторно открывают четыре группы крови. В 1907 году было предложено обозначать группы крови латинскими цифрами I, II, III и IV.

В 1908 году доктора Эпстайн и Оттенберг проводят первое популяционное исследование групп крови системы I, II, III и IV [6]. Но, используя латинскую нумерацию по Янскому и Моссу и исходя из существования четырех независимых групп крови, они не могут установить точного механизма наследования.

В 1910 году доктора Дунгерн и Хирсзфельд, используя номенклатуру Ландштейнера и Декастелла — Стурли и исходя из существования трех независимых групп крови (A, B и 0) и одной смешанной (AB), провели популяционное исследование, давшее предположение о существовании двух независимых пар генов — пары A и a, определяющее присутствие или отсутствие агглютиногена A, и пары B и b, определяющее присутствие или отсутствие агглютиногена B [7].

В 1911 году Дунгерн и Хирсзфельд показали наличие подгрупп крови A1 и A2 [8]. Фактически это первое исследование, определившее наличие неоднородностей при серологической идентификации одной и той же группы крови и возможном наличии двух аллелей для гена, определяющего присутствие агглютиногена A.

Однако только в 1924 — 1925 годах была предложена модель наследования для системы групп крови AB0, признанная в настоящее время. Эта модель была предложена профессором математики Феликсом Бернштейном [9], [10]. Бернштейн решил проблему наследования, адаптировав для системы групп крови AB0 новый в то время метод популяционной генетики — закон Харди — Вайнберга, предложенный в 1908 году независимо английским математиком Харди и немецким врачом Вайнбергом. Бернштейн предложил модель трехаллельного (A, B и 0) наследования одного гена, подчиняющегося законом Менделя и осуществляющееся по кодоминантному типу (т.е. посредством двух независимых друг от друга аллелей A и B), а аллель 0 имеет рецессивный характер наследования.

До 1940 года для данной системы групп крови использовались две номенклатуры обозначения I, II, III, IV и AB0 — 0 (I), A (II), B (III), AB (IV). Но начиная с 1940 года из-за проблем, связанных с возникающими ошибками при переливаниях крови, в госпиталях повсеместно была утверждена номенклатура обозначения AB0.

Фактически за период с 1900 по 1960 год было создано одно из важнейших научно-практических направлений в гематологии и криминалистике — направление типирования групп крови по системе AB0, которое в настоящий момент используется во многих областях практической медицины. Наиболее полный обзор становления этого важнейшего направления до 1966 года представлен в работе одного из отцов современной гематологии и криминалистики профессора медицинской криминалистики Александра Винера [11].

Система AB0 является самым первым маркером типирования человеческой популяции. Кроу в своей работе подчеркнул, что в настоящее время известны тысячи полиморфизмов, используемых как человеческие хромосомные маркеры, а в первой половине XX века был только один маркер — система типирования групп крови AB0, хотя и с неустановленным до конца в то время механизмом наследования [12].

Несмотря на то что серологическое типирование групп крови стало использоваться в криминалистике начиная с 20-х годов прошлого столетия [11], наибольшее количество исследований по AB0-типированию в мире проводилось и проводится для клинических целей. Серьезное увеличение финансирования таких работ наблюдается в период активных боевых действий. Каждая крупная война с начала прошлого века характеризуется резким увеличением количества работ по изучению типирования групп крови. Вторая мировая война и война в Корее характеризуются наибольшим количеством таких работ [13], [14], [15], [16], [17] и т.д. Кроме увеличения финансирования работ в военный период, возрастает и число пациентов, которым необходимы трансфузиологические мероприятия, а соответственно, данные пациенты являются и обширным материалом для исследований.

Еще в начале прошлого века стало ясно, что группы крови могут делиться на подгруппы, что побудило проводить обширные популяционные исследования. Такие популяционные исследования и стали основой для создания тест-систем для криминалистического типирования AB0 [11].

Согласно современным представлениям A, B и H антигены (соответственно в старых работах: агглютиноген A, B или 0) являются продуктом не прямой экспрессии генов, а продуктом реакции ферментов, называемых гликозилтрансферазами. AB0-полиморфизм выражен в полиморфизме комплексов карбогидратных структур гликопротеинов и гликолипидов, экспрессирующихся на поверхности эритроцитов и других клеток, или присутствующих в жидкостных аналитах в форме гликановых единиц мициновых гликопротеинов. Ген, кодирующий A- и B-гликозилтрансферазу, расположен на 9-й хромосоме (район 9q34.1-34.2) [18]. A- и B-гликозилтрансферазы присоединяют к фукозилированному остатку галактозы антигена H N-ацетилгалактазамин с образованием антигена A (a-GalNAc (I1-3) (3-Gal (1-3 или 4) 18-GlcNAc)) или остатка галактозы с образованием антигена B (a-Gal (I1-3) 13-Gal (1-3 или 4) f8-GlcNAc), а также без изменения антигена H (a-8-Ga (I1-3 или 4)/3-GlcNAc) для случая 0 аллели [19]. Функции ABH антигенов в организме до сих пор не понятны.

Ген, кодирующий гликозилтрансферазу, состоит из 7 экзонов и 6 интронов (GenBank: http://www.ncbi.nlm.nih.gov, accession number NC_000009.10). Общая протяженность гена на физической карте генома человека составляет около 18 тысяч пар нуклеотидов [18], на физической карте генома человека с позиции 135140451 до позиции 135120384 (GenBank: http://www.ncbi.nlm.nih.gov, Chromosome 9, Location: 9q34.1-9q34.2, AB0 in Map Viewer). Размер экзонов колеблется от 28 до 688 пар нуклеотидов [20]. Размер интронов колеблется от 554 до 12982 пар нуклеотидов [21], [22], [23]. Два последних экзона кодируют каталитический домен AB0 гликозилтрансфераз [19], [20]. Из этого следует, что для генетического типирования A и B групп крови наиболее интересны именно 6-й и 7-й экзоны, в то время как для типирования группы 0 необходимо рассматривать более протяженный участок гена.

Поиск нуклеотидных различий для аллелей AB0 начался сразу после того, как в 1990 году был клонирован фрагмент кДНК длиной 1062 пары нуклеотидов, соответствующий мРНК варианта A-гликозилтрансферазы — белка весом 41 кДа [24]. Была определена первичная последовательность этого фрагмента кДНК (GenBank: http://www.ncbi.nlm.nih.gov, accession number NM_020469.02).

В том же 1990 году Ямамото с соавторами [24], [25] показал наличие четырех нуклеотидных замен, различающих гликозилтрансферазу A и B типов. Фактически это означало, что эксперименты Карла Ландштейнера [1] с кровью одного индивида и сывороткой другого блестяще подтвердились на молекулярном уровне спустя 90 лет [26].

В 1992 году были впервые проведены исследования возможности использования аллель-специфической полимеразно-цепной реакции (ПЦР) для идентификации AB0 аллелей [27], [28]. В работе [28] было исследовано 6 основных AB0 генотипов и была показана информативность ДНК-маркеров на уровне не менее 60 — 70%. Такие результаты позволили авторам работ сделать вывод о возможности использования ДНК-маркеров системы AB0 в криминалистических исследованиях.

В 1997 году был найден гибридный вариант аллели гена: экзон 6 соответствовал аллели B, а экзон 7 — аллели 01 [29]. Такой результат подтвердил возможность протяженных рекомбинационных перестроек внутри гена.

В 2001 году были исследованы случаи атипичных серологических определений методами анализа ДНК [30]. Атипичные случаи определений представляют серьезную проблему как в клинической практике, так и в криминалистической. Данные исследования прибавили к 14 известным к тому моменту аллелям AB0 еще 15 новых, в результате доведя общую численность до 29. 15 новых аллелей были определены как принадлежащие к A и B подгруппам. В исследовании использовался участок гена с фланкирующими районами, что позволило определить 2 аллели для A и B подгрупп вне экзона 7. Этот факт наиболее интересен, поскольку эти две аллели лежат вне зоны, непосредственно кодирующей каталитический центр трансферазы. Эти аллели получили название «weak» (мягкие).

Уже к 2002 году было определено свыше 70 основных аллелей, которые соответствуют нормальным группам крови A, B, AB и 0 [31]. Часть из этих аллелей соответствовала вариациям первичной последовательности ДНК в некодирующих областях, в том числе и в интроне 6. Ответственными за возникновение части этих аллелей было предложено считать мутационные и внутригенетические рекомбинационные процессы (кроссовер и генетическую конверсию). В работе [31] была предложена унифицированная номенклатура обозначения этих аллелей.

К 2003 году было сообщено об определении 83 [32], а затем и 88 [33] аллельных вариантов. В работах [32], [33] было показано наличие большого количества вариаций первичной последовательности ДНК в интронах и некодирующих областях гена. Ольга Блюменфельд [33] в своей работе систематизировала данные для генетического типирования AB0 и разработала первую базу данных, состоящую к тому времени уже из 88 аллелей. В 2004 году на конференции в Торонто (Канада) сотрудники департамента биохимии Медицинского колледжа им. Альберта Эйнштейна Ольга Блюменфельд и Сантошо Патнаик предложили на рассмотрение окончательно сформированную базу данных по генетическим вариациям антигенов групп крови, в том числе и системы AB0 [34].

К настоящему моменту определено порядка 180 аллелей для AB0 системы. Сотрудники департамента биохимии Медицинского колледжа им. Альберта Эйнштейна составили уже электронную базу данных вариаций в генах, кодирующих антигены разных систем групп крови, в том числе и для системы AB0 (BGMTU: http://www.aecom.yu.edu/bgmut/index.htm). По состоянию на июль 2007 года в базе содержится информация для 62 аллелей группы A, для 46 аллелей группы B, для 66 аллелей группы 0 и для 5 cis-аллелей (трансферазы, экспрессируемые с cis-аллелей, обладают смешанной AB-активностью [35], [36], [37], [38]).

Основные типы аллелей групп крови по системе AB0 можно разделить на следующие группы: A, B, 0, cis-AB. Далее все аллели приводятся в соответствии с номенклатурой базы данных департамента биохимии Медицинского колледжа им. Альберта Эйнштейна (BGMTU: http://www.aecom.yu.edu/bgmut/index.htm) и в соответствии с работами [30], [31]. Необходимо отметить, что высокое аллельное разнообразие стало доступно только после начала исследования системы AB0 на уровне первичной последовательности ДНК и зачастую изучение свойств новых аллелей серологически происходило после их открытия методами ДНК-исследований гена.

Ниже приводится краткая характеристика наиболее интересных подгрупп аллелей.

Фенотипически (по результатам серологических определений) делятся на подгруппы A1, A2, A3, Ael, Aweak, Am, Aw, Ax. Генетическое деление аллелей намного сложнее. Согласно данным Ямамото [21], отличительной особенностью генотипов аллелей группы A (по сравнению с группой B) является наличие следующих характеристических нуклеотидов в соответствующих позициях (отсчет ведется по кДНК [21]): поз. 294 (A), 523 (C), 654 (C), 700 (G), 793 (C), 800 (G), 927 (G). Для первичной последовательности кДНК, представленной в GenBank (GenBank: http://www.ncbi.nlm.nih.gov, accession number NM_020469.02), для правильного определения позиций нуклеотидов необходимо сделать сдвиг отсчета нуклеотидов на -3. Четыре из характеристических нуклеотида: 526 (здесь позиции в соответствии с GenBank: http://www.ncbi.nlm.nih.gov, accession number NM_020469.02), 703, 796 и 803 — определяют тип трансферазы (A или B), поскольку лежат в области кодирования каталитического центра фермента и замены нуклеотидов приведут к заменам аминокислотных остатков в самом ферменте и изменению активности (миссенс-замены).

По степени выраженности реакции агглютинации можно разделить аллели группы A на сильные (A1) и слабые (A2, A3, Ael, Aweak, Am, Aw, Ax). Генотип слабых аллелей формируется в основном за счет определенных замен нуклеотидов на участке, кодирующем каталитический центр (в основном), что приводит к сохранению типа трансферазы, экспрессируемой с данной аллели, но потере ферментативной активности (аналогично и для группы B).

Подгруппы A1 и A2 были определены еще в исследованиях 1911 года [8] и были заново открыты в 1923 году Кокой и Клейном [39]. Это классические подгруппы группы A, каждая из которых характерна своим ферментом и антителами, специфически узнающими A1 или A2. Выраженность реакции агглютинации для аллели A1 обычно принимают за 100%, и тогда выраженность реакции агглютинации для аллели A2 будет ниже 40%. Подгруппа A2 встречается примерно у 20% лиц с группами крови A и AB. Усредненная частота встречаемости аллели A2 — около 3 — 5% [40]. Антиагглютиноген A2 определяется специальными активными сыворотками или лектинами [11], [41]. При отсутствии активных сывороток анти-A лица с генотипом A20 могут быть ошибочно отнесены к группе крови 0, а лица с генотипом A2B могут быть ошибочно отнесены к группе крови B [41].

Аллель A1 в гетерозиготном состоянии хорошо маскирует при серологическом определении аллели более слабые Ael и Ax [30].

Аллель A2 отличается от A1 наличием замены в поз. 297 (C на T, соотв. Pro на Leu) и делеции в поз. 1059 [24], [25], [42].

Аллели A3, Ael, Ax характерны тем, что в их случае наблюдается усиленная экспрессия H-антигена [43], [44].

Подгруппа Aweak характеризуется крайне низкой A-агглютиногеновой активностью — на уровне 10 — 12% [19].

Согласно данным Ямамото [21], отличительной особенностью генотипов аллелей группы B (по сравнению с группой A) является наличие следующих характеристических нуклеотидов в соответствующих позициях (отсчет ведется по кДНК [21]): поз. 294 (G), 523 (G), 654 (T), 700 (A), 793 (A), 800 (C), 927 (A). Для первичной последовательности кДНК, представленной в GenBank (GenBank: http://www.ncbi.nlm.nih.gov, accession number NM_020469.02), для правильного определения позиций нуклеотидов необходимо сделать сдвиг отсчета нуклеотидов на -3. Четыре из характеристических нуклеотида: 526 (здесь позиции в соответствии с GenBank: http://www.ncbi.nlm.nih.gov, accession number NM_020469.02), 703, 796 и 803 — определяют тип трансферазы (см. выше).

Фенотипически (по результатам серологических определений) делятся на подгруппы B, B(A), AweakB, (B(A), определяемая как AwB), B3, Bw, (B в Bvar/001 или A1B3 в A101/Bvar), Bel, Bel (очень слабая B-антигеновая экспрессия), Bx.

По степени выраженности реакции агглютинации можно разделить аллели группы B (так же как и аллели группы A) на сильные и слабые (к сильным принадлежит аллель B, все остальные — слабые).

Интересна также подгруппа B(A), для которой характерна пониженная B-трансферазная активность вследствие замены Pro234 на Ala из-за замены C на G в поз. 703 первичной последовательности ДНК (отсчет по кДНК [45], для соответствия NM_020469.02 нужно сделать сдвиг -3) [46]. Существенная потеря трансферазной активности в данном случае происходит из-за изменения каталитического центра фермента (7-й экзон). Для такой аллели при серологическом исследовании наблюдается существенное возрастание A — агглютиногенной активности, что может привести к неправильному определению фенотипа.

Фенотипически (по результатам серологических определений) эта группа обычно не разделяется на подгруппы. Однако существуют варианты отсутствия и присутствия немодифицированного антигена H. Антиген H может отсутствовать из-за потери экспрессии самого антигена H (за синтез и модификацию которого ответственны H (FUT1) и SE (FUT2) локусы, расположенные на 19-й хромосоме). Фенотип 0h получил название «бомбейского» в соответствии с названием первой популяции, в которой его обнаружили [47]. Отсутствие антигена H представляется весьма редким случаем, но для них может наблюдаться несоответствие результатов серологического определения методам анализа первичной последовательности ДНК, т.е., несмотря на присутствие трансфераз A или B типа, серологическое тестирование всегда будет определять 0.

Генотип 01 характерен наличием делеции G (по сравнению с A1) в поз. 261 (по кДНК, NM_020469.02), из-за чего образуется стоп-кодон (нонсенс-замена) в поз. 118 [48]. Поэтому такая аллель экспрессирует каталитически неактивный фермент.

Генотип 02 характерен (по сравнению с A1) наличием нуклеотидов в поз. 297 (G), 526 (G), 802 (A). Значимой является только замена в 526 и 802 [21], [42], [49], нумерация соответствует работе [45], для соответствия NM_020469.02 нужно сделать сдвиг -3.

Характеризуется смешанной AB-трансферазной активностью. Например, смешанная AB-трансферазная активность наблюдалась вследствие замены Pro 156 на Leu из-за замены C на T в поз. 467 первичной последовательности ДНК (отсчет по кДНК [24]). Активность трансферазы для такой аллели слабая — меньше 50% [19], [50], [51], [52], [53], [54], [55].

К настоящему моменту известно много вариаций первичной последовательности ДНК-гена, кодирующего гликозилтрансферазы (соответствующее A-, B- или 0-антигену), в дополнение к тем, что приведены в данной работе.

Первое популяционное исследование по системе AB0 было проведено в 1910 году докторами Дунгерном и Хирсзфельдом (см. выше [7]), а первое предложение использовать систему AB0 для анализа этнического происхождения была высказано в 1918 — 1919 годах [56]. Данные, полученные в то время, свидетельствовали о том, что частота встречаемости генотипа, определяемого серологически как B, постепенно увеличивается при движении по Евразии от 10% (Англия) до 50% (Индия). Частоты встречаемости генотипа, определяемого серологически как A, примерно одинакова по всей Европе, незначительно ниже в России и на Среднем Востоке. А в Африке и Индии частота встречаемости группы A существенно уменьшается. Усредненный «биохимический показатель» — отношение частоты группы A к частоте группе B, введенный в работе [56], позволил выделить три группы человеческой расы: европейскую (2,5 — 4,5), азиатско-африканскую (0,5 — 1,09) и смешанную (1,3 — 1,5) [57].

Различия в частотах встречаемости аллелей, определяющих группы крови, хорошо отражают дифференциацию генофонда населения Земли в целом [57].

Географические границы позволяют выделить пять расовых групп: африканскую, европеоидную (кавказскую), негроидную, монголоидную, индейцы Америки, аборигены Австралии. В таблице 1 представлены частоты встречаемости аллелей групп крови A и B среди мировых популяций [58]. Данные по американской популяции приведены в таблице 2.

Таблица 2. Данные по средним частотам встречаемости (%) в американской популяции по состоянию на 2006 год

Необходимо отметить, что индейцы Южной Америки проявляют в основном фенотип, соответствующий аллели 0, в то время как частоты встречаемости других аллелей крайне малы.

Данные для жителей стран СНГ совпадают с данными для мировых популяций. Например, данные по частотам встречаемости для жителей Украины представлены в таблице 3.

Таблица 3. Частоты аллелей (%), определяющих группы крови у жителей Украины, по состоянию на 1987 год [41], [59]

Однако серологическая дифференциация человеческого населения Земли по системам групп крови AB0 в криминалистике иногда бывает несколько затруднена из-за наличия большого количества обособленных и условно-обособленных популяционных группировок с эффектом «бутылочного горлышка» и очень резкими частотными границами [57].

Изменчивость частот групп крови по системе AB0, определяемых серологическими методами, относительно невысока по сравнению с другими системами определения групп крови [57]. Однако высокое разнообразие первичной последовательности ДНК-гена, кодирующего A- и B-гликозилтрансферазу, позволяет существенно расширить количество генотипов, используемых для идентификации.

У человека окончательная картина экспрессии антигенов ABH и соответствующих им антител формируется постепенно. Антигены начинают устойчиво идентифицироваться только с 5-й недели развития плода. У новорожденных эритроциты имеют сниженное число группоспецифических антигенов, которые достигают своей нормальной активности только к 3 годам. В сыворотке крови новорожденных антитела анти-A и анти-B находятся в низком титре, а у недоношенных детей почти отсутствуют. Только с 3 — 6-го месяца после рождения групповые изогглютиногены начинают обнаруживаться устойчиво и достигают пика титра к 5 — 10 годам. С 5 до 70 лет наблюдается плато с примерно одинаковым титром антител и агглютиногенной активностью клеток крови (в отсутствие трансфузиологических и трансплантологических мероприятий). Снижение титра наблюдается примерно к 80 — 100 годам и приближается к уровню новорожденных [41], [60].

Группа крови в течение жизни при нормальных условиях остается неизменной, но под действием патологических процессов экспрессия эритроцитарных антигенов может ослабеть или полностью остановиться. Чаще всего это происходит при злокачественных заболеваниях [41], [61], [62]. Наибольшим изменениям подвергается антиген A под действием бактериальных ферментов, особенно тех, которые ассоциированы с кишечными инфекциями: может происходить деацилирование антигена A, и тогда у лиц с генотипом A может наблюдаться фенотип B. Несколько пациентов, больных гастроэнтеральными инфекциями [43], [63], показали наличие в крови антиагглютиногена B, достаточное для устойчивого определения, в то время как их генотипы соответствовали аллелям группы A. После выздоровления нормальный фенотип восстановился [30], [43], [63].

Известно также об изменениях способности к образованию групповых антител анти-A и анти-B и агглютиногенов A- и B- при злокачественных и незлокачественных новообразованиях [64]. Изменение AB0-статуса наблюдается при таких заболеваниях, как миелогенная лейкемия, множественные миеломы, лимфома Ходжкина, миелодиспластический синдром, аденокарциномы кишечника или уретры, гинекологические карциномы. Например, при некоторых разновидностях лимфом кровь некоторых пациентов показывает наличие полиагглютиногена, хотя генотип соответствует 0101V. Так же кровь некоторых пациентов, больных миелодиспластическим синдромом, показывает наличие агглютиногена, определяемого как A, хотя генотип соответствует 01V01V [30].

Беременность также является фактором, влияющим на правильность определения AB0-статуса. Например, в крови беременных женщин было определено наличие крайне слабого агглютиногена A, идентифицированного как Aweak, хотя их генотип соответствовал чистому A. Вариабельность в экспрессии A-агглютиногена у беременных практически повсеместно признана нормальным сопутствующим явлением. У некоторых такое ослабление наблюдается в течение лишь короткого периода беременности (обычно первые 6 месяцев после зачатия), а у некоторых сохраняется достаточно длительное время после рождения ребенка, но нормальная экспрессия восстанавливается практически во всех случаях. Такая картина наблюдается, как правило, для гетерозиготного генотипа с участием аллели A [30].

У пациентов, перенесших многократные хирургические операции (в том числе и ортопедические), может содержаться в крови агглютиноген, не совпадающий с генотипом, или слабо экспрессируемый агглютиноген собственной аллели [30].

Существенное ослабление экспрессии агглютиногена A и B (в основном это касается A-агглютиногена) до уровня мягких аллелей наблюдается у регулярных доноров и больных, перенесших химиотерапию [30].

При клинических исследованиях среди групп больных встречается до 20 — 30% абнормальных случаев определения группы крови по системе AB0 серологическими методами [30], [43], [63]. Поэтому для криминалистических исследований целесообразней использовать более достоверные методы — методы изучения первичной последовательности ДНК.

ДНК тест-системы для определения генотипа AB0 и ограничения, накладываемые сохранностью и количеством биоматериала

Для исследования генотипов системы AB0 за последние 17 лет после определения первичной последовательности кДНК и последовательности самого гена было использовано множество различных тест-систем. Однако ограничения на тест-системы при криминалистических исследованиях не позволяют использовать любые, которые пригодны для медицинских целей. Криминалистические образцы биоматериала с места происшествия характеризуются плохой сохранностью, наличием примесей и загрязнений, малым количеством ДНК для исследований, сильной степенью деградации ДНК. Поэтому для ДНК-исследований криминалистических образцов необходимо использовать тест-систему, которая позволяет анализировать относительно короткие фрагменты деградированной ДНК, совмещать много реакций в одной пробирке (мультиплексный ПЦР), анализировать малые и сверхмалые количества сильно деградированной ДНК и достоверно устанавливать генотипы.

Хорошо подходит для генетического типирования групп крови по системе AB0 метод анализа однонуклеотидных замен (single nucleotides polimorphism) SNP, поскольку основные генотипы аллелей определяются именно за счет однонуклеотидных замен. Принцип метода основан на анализе первичной последовательности ДНК относительно короткого локально-амплифицированного района генома (от 50 до 250 п. н.). Анализ первичной последовательности может проводиться в трех основных вариантах: прямым секвенированием, методом SSCP (single strand conformation polimorphism) — конфармационного полиморфизма одноцепочечной ДНК и методом детекции на микрочипах. SNP-метод хорошо подходит для анализа сильно деградированной ДНК, поскольку для определения полиморфизма не требует протяженных фрагментов ДНК (как, например, STR) и позволяет одновременно анализировать несколько локусов [65]. В случае определения полиморфизма на микрочипах SNP-метод становится крайне время- и затратосберегающим. Многие исследователи использовали SNP-метод для исследования криминалистических образцов по системе AB0.

Наиболее интересные ДНК тест-системы для исследований генотипов AB0 приводятся в работах [30], [32], [40], [42], [44], [65], [66], [67] и т.д.

Проблемы, возникающие при криминалистических исследованиях, хорошо изложены в работах [65], [67]. Авторы рассматривают случай сильно деградированной ДНК из костных останков плохой сохранности. В работе [65] использовались праймерные пары:

В работе тестировались поз. 261 и 297 (по кДНК). Продукт амплификации для первой праймерной пары имеет размер 205 п. н., а для второй — 138 п. н. Как видно из первичной последовательности (GenBank: http://www.ncbi.nlm.nih.gov, accession number NM_020469.02), вторая праймерная пара лежит внутри фрагмента амплифицируемого первой праймерной парой (всего на несколько нуклеотидов выходя за его границы с одного конца) и оба фрагмента амплифицируются с 6 экзона. В результате проведенного исследования было показано, что из 6 образцов (сильно загрязненных костных останков плохой сохранности) 4 были хорошо идентифицированы по малому фрагменту, а по большому — идентифицирован лишь 1 образец. Аналогичные результаты были получены также для разных типов загрязненного биоматериала плохой сохранности.

Учитывая опыт своей предыдущей работы [65], в дальнейших исследованиях [67] авторы использовали 3 фрагмента локальной амплификации: первые два из предыдущей работы, а третий был получен с использованием дополнительного обратного праймера 5′-CTGCTCGTCGAGGATGTCGA-3′, а прямой был один из предыдущей работы. После амплификации с дополнительным праймером был получен фрагмент размером 89 п. н. Относительное количество образцов, которое удалось типировать, совпало приближенно с предыдущими исследованиями, но для 89 п. н. фрагмента количество случаев удавшегося типирования было наибольшим. Из результатов этих работ можно сделать вывод, что размер амплификационного фрагмента для тестирования криминалистических образцов плохой сохранности (костных останков) должен быть меньше 200 п. н., а оптимальный размер — не более 100 п. н.

До настоящего времени 90 — 95% объектов биологического происхождения, изымаемых с мест происшествий, исследуется традиционными (серологическими) методами исследования, так как не требует больших финансовых затрат и дорогостоящего оборудования. Учитывая то, что эти объекты чаще всего характеризуются наличием примесей и загрязнений различного характера, в том числе бактериальных и грибковых, малым количеством, последствиями воздействия неблагоприятных условий внешней среды (влажность, температура, ультрафиолетовое излучение и др.), часто традиционными методами исследования не удается установить группу крови по системе AB0, или она устанавливается недостоверно. Необходимость установления группы крови по системе AB0 в биоматериале с мест происшествий обусловлена тем, что она относится к самой распространенной в медицинской практике, в связи с чем есть возможность проведения поиска лица путем проведения сравнения результатов исследований с записями о группе крови в историях болезни, медицинских картах, паспортах. Это очень важно на первых этапах расследования, так как позволяет сузить круг подозреваемых лиц. Поэтому для установления системы AB0 в криминалистических образцах необходима разработка ДНК тест-систем, которые не только позволят анализировать малые и сверхмалые количества биоматериала и достоверно устанавливать генотипы, но и были бы удобны в практическом применении экспертами-биологами, что позволит существенно сэкономить время и средства. А современные научные разработки в этом направлении позволят осуществить эту задачу в кратчайшие сроки.

Кому и зачем нужна трансплантация костного мозга? Кто может стать донором? Трансплантация костного мозга (ТКМ) используется, прежде всего, при лечении онкологических заболеваний, таких как лейкозы, поражения лимфатической системы, нейробластома, а также при апластической анемии и ряде наследственных дефектов крови.

Костный мозг — важнейший орган кроветворной системы, осуществляющий кроветворение — процесс создания новых клеток крови взамен погибающих и отмирающих. Костный мозг находится в костях и внешне не отличается от крови. Только он содержит стволовые клетки, которые отвечают за иммунитет и производство лейкоцитов, тромбоцитов и эритроцитов.

Донором может стать любой человек в возрасте от 18 до 45 лет весом от 50 кг, если у него не было гепатитов В и С, туберкулеза, малярии, ВИЧ, нет онкологического заболевания или диабета.

Прийти в НМИЦ гематологии, подписать согласие на донорство.

Сдать 9 мл крови из вены для типирования и занесения в базу доноров.

Если набор генов донора совпал с реципиентом, донора приглашают в больницу сдать КМ.

Под общим или эпидуральным наркозом донору делают несколько проколов в подвздошных костях и извлекают костный мозг.

КМ восстанавливается через 2 недели, в течение нескольких дней донор ощущает небольшое недомогание.

За 10 дней до процедуры донор принимает препарат, стимулирующий активный выброс стволовых клеток в кровь.

Кровь из вены проходит через прибор, отделяющий стволовые клетки, и возвращается через вену на другой руке. Процедура длится 5-6 часов.

Полученные стволовые клетки вводятся через вену больному лейкозом.

После трансплантации КМ большинство пациентов выздоравливают и возвращаются к обычной жизни.

Сдать кровь на типирование можно в НМИЦ гематологии или Инвитро

Сегодня более 350 тыс. россиян страдают от лейкоза – рака крови. Около 60% из них нуждается в трансплантации костного мозга, при этом не более 20% из них имеют совместимого родственного донора. Поэтому большинство пациентов нуждается в поиске неродственного донора.

Саму процедуру трансплантации оплачивает государство, но поиск и активация донора стоит немалых денег. Если донор найден в России, то пациенту за обследование донора и заготовку трансплантата придется заплатить более 350 тыс. рублей, а поиск и заготовка за рубежом стоит более 1,4 млн рублей. Именно поэтому так важно пополнять российский регистр доноров костного мозга. Мы расскажем о том, что такое костный мозг, как его получают и как войти в регистр доноров.

Несмотря на то, что стать донором – просто и безопасно, по состоянию на сентябрь 2018 года отечественная база данных насчитывает всего чуть более 84 тыс. желающих. В международном регистре их более 32 млн, но для многих пациентов счет на 1,5 млн миллиона за поиск и активацию — неподъемная сумма. Между тем, после трансплантации КМ большинство пациентов выздоравливают и способны вернуться к обычной жизни!

Костный мозг (КМ) – это орган кроветворной системы, который находится в костях и зрительно похож на кровь. В нем находятся стволовые клетки, отвечающие за иммунитет, обновление и восстановление кроветворной системы. Поэтому донорский КМ применяется при лечении онкологических болезней, например, лейкозов, лимфом, нейробластом и т.д. Больному вводят здоровые стволовые клетки донора, и они восстанавливают способность его организма к нормальному кроветворению, уничтожая опухолевый клон. Иногда это единственная возможность сохранить человеку жизнь.

Сдать КМ может любой желающий в возрасте от 18 до 45 лет весом от 50 кг, если у него самого нет онкологических заболеваний, диабета, инфекций, которые могут передаваться с переливанием крови (ВИЧ, гепатиты В и С), туберкулеза, малярии, а также тяжелых хронических заболеваний.

Чтобы проверить, насколько подходит для трансплантации костный мозг другого человека, проводят анализ крови на определение HLA-генотипа – набор генов, отвечающих за совместимость тканей. HLA-идентичным родственным донором может быть только родные брат или сестра. В некоторых случаях по жизненным показаниям трансплантация может быть выполнена от родителей.

Подходящим донором может оказаться и незнакомый человек, иногда даже из другой страны. Найти такого можно в специальных регистрах.

Сегодня регистры потенциальных доноров КМ существуют по всему миру. Самый крупный – Международный регистр IBMTR – содержит данные о 32,7 млн доноров из всех мировых баз данных. Говоря об отдельных странах, в национальном регистре Германии хранится информация о 8 млн, США – о 9 млн., России – чуть больше 84 тыс. доноров.

Есть два способа сдать КМ:

1. Под наркозом у донора делают несколько проколов в подвздошных костях (эксфузия), и при помощи полой иглы и шприца осуществляют забор КМ из тазовых костей. Пару дней после процедуры донор может чувствовать недомогание, и слабость. Выписка из больницы происходит через 1-2 дня после эксфузии. КМ донора восстанавливается уже через две недели.
2. За 3 дня до заготовки донору вводят специальный препарат, стимулирующий активный выброс стволовых клеток в кровь. В больнице у него берут кровь из вены, пропускают ее через специальный прибор, отделяющий стволовые клетки, и через вену на другой руке возвращают обратно. Процедура длится около 5-6 часов.

Чтобы стать донором, нужно прийти в НМИЦ гематологии или Инвитро и сдать кровь для типирования, результаты которого в дальнейшем будут занесены в единую базу доноров РФ. Если ваш набор генов совпадет с набором реципиента, вас пригласят в больницу для беседы с врачами, дообследования перед заготовкой КМ.

Сегодня существует очень много пациентов, которым необходим КМ донора, чтобы выжить, для многих из них можно найти донора только в России. Это связано с тем, что население нашей страны генетически похоже. Поэтому так важно пополнять российский регистр доноров костного мозга. Увеличение численности национального регистра дает возможность найти и активировать донора для пациента значительно быстрее и дешевле. А это значит, больше шансов подарить и продлить кому-то жизнь. Ведь необходимость такой помощи может понадобиться каждому из нас.

Сдать кровь на типирование можно с 8.00 до 14.00 по адресу:
Новый Зыковский проезд. д.4, ФГБУ «НМИЦ гематологии»
На проходной сказать, что вы в донорский отдел.
После проходной повернуть налево и идти к указателю «Вход для доноров». А также в любой лаборатории Инвитро.

Вы сможете осуществить разовый или подписаться на периодический платеж при помощи:

Отправьте СМС со словом «Спасти» и суммой пожертвования на номер 3434. Например, «Спасти 500». Следом придет СМС-сообщение с просьбой подтвердить платеж, на которое вам нужно будет ответить. О том, что пожертвование прошло, вас известит сообщение от Фонда.

Вы можете оформить разовый перевод на наш расчетный счет в рублях или валюте или написать заявление на регулярное списывание средств с вашего счета. Для оформления регулярного списания средств с банковского счета в пользу Фонда Вам необходимо обратиться к сотруднику Вашего банка. Вам понадобится только Ваш паспорт и реквизиты Фонда.

Без переливания донорской крови и ее компонентов невозможно лечение пациентов нашего Центра. Некоторым пациентам бывает нужно лишь однократное переливание, чтобы компенсировать кровопотерю. Пожалуйста, найдите силы и время, чтобы стать донором и поделиться тем, чему нет замены – своей кровью!

Чем больше людей узнают о нашем Фонде, тем большее количество поддержки смогут получить наши подопечные. Расскажите родным и друзьям о деятельности Фонда, сделайте пост в соцсетях, отправьте ссылки на истории пациентов знакомым, приходите на Донорские субботы и приводите новых людей, делитесь нашими новостями.

источник