Тест на циркулирующие опухолевые клетки
Метастатический рак – форма рака, при которой злокачественный процесс выходит за пределы одной опухоли и распространяется на другие отделы человеческого тела. Многие медицинские решения принимаются, исходя из того, насколько активно прогрессирует болезнь.
Чтобы точно ответить на вопрос о течении онкологического заболевания врачи используют данные, полученные в ходе инструментальных диагностических исследований, или результаты лабораторных тестов на онкомаркеры. Например, в ходе лечения рака предстательной железы на определенных стадиях проводятся анализы на специфический антиген простаты ПСА (Prostate-specific antigen, PSA).
В настоящее время появилась дополнительная возможность получить оперативную информацию при помощи специфического теста о состоянии здоровья и наблюдать за прогностическими изменениями на каждом этапе лечения. Результаты теста помогают лечащему врачу сделать правильный шаг.
CellSearch Circulating Tumor Cell Test — тест на циркулирующие опухолевые клетки (CTC ).
Циркулирующие опухолевые клетки (CTC) – это раковые клетки, отделившиеся от существующей в организме опухоли и попавшие в общий кровоток.
Наличие подобных клеток в крови представляет собой ценный прогностический признак, позволяющий определить степень прогрессирования злокачественного процесса. Клинические исследования доказали, что наличие циркулирующих опухолевых клеток в крови пациента и мониторинг их количества позволяет делать выводы о благоприятном или же неблагоприятном прогнозе для пациента с метастатическими онкологическими заболеваниями, такими как рак молочной железы, рак простаты или рак колоректального отдела кишечника.
Измерение количества циркулирующих опухолевых клеток (CTC) в крови перед началом курса лечения и на различных его этапах поможет лечащему врачу следить за динамикой в состоянии здоровья и принимать взвешенные решения о дальнейшем лечении.
Отзыв о лечении урологической онкологии в Израиле
Я хотел бы выразить свою искреннюю признательность за доброту и заботу, полученные в вашей клинике в ходе моего недавнего визита и лечения. Я очень ценю вашу помощь в эффективном решении всех вопросов. Выражаю особую благодарность первоклассным врачам и всему медицинскому персоналу, принимавшему участие в моем лечении.
Именно поэтому врачи больницы «Шиба» практикуют CellSearch Circulating Tumor Cell Test — тест на циркулирующие опухолевые клетки (CTC ) – для диагностики и мониторинга состояния своих пациентов.
Тест на циркулирующие опухолевые клетки (CTC)- представляет собой простой анализ крови, в ходе которого выявляют, идентифицируют и подсчитывают циркулирующие опухолевые клетки (CTC). Данный тест настолько точен, что позволяет распознать даже одну опухолевую клетку, присутствующую в пробирке с кровью пациента.
В качестве положительного или отрицательного прогностического признака применяются следующие критерии: 5 CTC при метастатическом раке молочной или предстательной железы; 3 CTC – при раке колоректального отдела кишечника.
Результаты клинических исследований доказали:
- Количество CTC ниже данного уровня является индикатором благоприятного прогноза
- Количество CTC в лабораторном образце выше данного уровня указывает на то, что болезнь может прогрессировать
Чтобы оценить изменения в размере опухоли у пациентов с метатстатическим раком молочной железы или колоректальным раком, врачи, как правило, используют технику медицинской визуализации, позволяющую установить, насколько эффективным является лечение. Данные диагностические проверки обычно назначают через 12 недель с момента начала курса лечения. Точно так же анали крови на ПСА у пациентов с метастатическим раком предстательной железы выполняют через несколько недель с момента начала приема лекарств.
Применение вышеперечисленных методик в комбинации с CellSearch Circulating Tumor Cell Test — тестом на циркулирующие опухолевые клетки (CTC) — предоставляет лечащему врачу возможность быстрее распознать изменения в состоянии здоровья пациента и получить более точный прогноз на будущее.
источник
Циркулирующие раковые клетки (ЦОК)
Опухолевые клетки от любого типа раковой опухоли могут поступать в кровь и лимфу и оседать в различных органах даже на самых ранних стадиях развития рака. Эти клетки называются циркулирующими опухолевыми клетками (ЦОК), если обнаруживаются в крови больных, или диссеминированными опухолевыми клетками (ДОК), если обнаруживаются в органах, в первую очередь, в костном мозге. Обнаружение ЦОК и ДОК у больных раком простаты, молочной железы или яичников, свидетельствует о гематогенной диссеминации опухоли или начала метастазирования. В Израиле уже выполняется этот анализ крови для метастазирующего рака груди, яичников и простаты. Он помогает врачу буквально с первых недель следить за ответом опухоли рака на проводимое лечение (химиотерапию).
Наличие этих клеток — фактор неблагоприятного прогноза, так как именно одиночные раковые клетки дают рост микро — метастазов спустя годы и десятилетия после радикальной операции.
Анализ на выявление циклирующих опухолевых клеток (ЦОК) – это новая проверка, утвержденная Американским управлением по продовольствию и лекарствам, а в последнее время и Израильским министерством здравоохранения для больных метастазирующим раком простаты и груди. Проверка динамики количества ЦОК в крови пациентов с раком простаты или груди показало более точную динамику, чем анализ уровня онкомаркеров. Технологии тестирования для остальных типов рака находится в процессе разработки и утверждения и в скором будущем появится в Израиле.
Почему опасны опухолевые клетки
Циркулирующие раковые клетки имеют сходство со стволовыми раковыми клетками в том, что они значительно чаще экспрессируют маркеры стволовых клеток, чем первичная опухоль; способны к самоподдержанию и длительному на хождению в покоящемся состоянии, обладают пластичностью, т.е. способностью превращаться в мезенхимальные клетки и обратно. Немаловажное сходство так же — резистентность к химио лучевой терапии.
Колонизация или заселение первичной опухоли циркулирующими или диссеминированными опухолевыми клетками — новый и очень важный фактор опухолевой прогрессии:
- циркулирующие клетки повторно инфильтрируют (заселяют) опухоль;
- не требуется адаптации циркулирующих клеток к микроокружению первичной опухоли;
- проникая в первичную опухоль, ЦОК ускоряют ее рост;
- отбираются циркулирующие опухолевые клетки, способные к экстравазации и выживанию в крови;
- в ходе колонизации первичной опухоли происходит отбор наиболее агрессивных популяций циркулирующих опухолевых клеток, способных к метастазированию в различные органы;
- проникновение ЦОК в опухоль — это активный процесс, так как циркулирующие клетки воспринимают сигналы опухоли.
Эти фундаментальные данные, полученные в эксперименте, могут иметь очень важное клиническое значение. Одно из самых загадочных явлений в канцерогенезе — пребывание циркулирующих опухолевых клеток в дремлющем состоянии, состоянии спячки в течение нескольких лет и десятилетий. Механизмы, управляющие пребыванием циркулирующих и диссеминированных раковых клеток в состоянии спячки, разнообразны.
Начало метастазирования
Существует клеточная спячка и спячка микрометастазов. В случае спящих микрометастазов важную роль играет баланс ангиогенных и антиангиогенных факторов. При наличии солитарных, разрозненных диссеминированных клеток ангиогенные стимулы роли не играют. А вот иммунная система, как предполагают, играет роль в поддержании в неактивном состоянии как разрозненных диссеминированных опухолевых клеток, так и микрометастазов.
В ближайшее время в Европе и США будут проводиться исследования с целью выяснить, может ли этот тест улучшить выживаемость пациентов с ранними стадиями рака. В настоящее время существует только один стандартный и проверенный тест, утвержденный администрацией американского комитета по продовольствию и лекарственным препаратам для обнаружения ЦОК, который называется системой CellSearch.
CellSearch представляет простой анализ крови, в котором собираются и оцениваются ЦОК для определения прогноза развития болезни у пациентов с метастазами рака молочной железы, рака толстой кишки, рака простаты. Этот тест, однако лишь подсчитывает количество ЦОК и следовательно нужно найти новые технологии, чтобы охватить большее количество клеток, клеток различных популяций. Проверка следит за немногочисленными злокачественными клетками, отделившимися от первичной опухоли и циркулирующим в кровообращении. Новейшие технологии позволяют обнаружить эти клетки с помощью простого анализа крови.
В отличии от визуализационных обследований, предоставляющих информацию о масштабе опухоли и новых зонах метастазов раз в несколько месяцев, данная проверка предоставляет информацию о биологической характеристике злокачественной опухоли, о состоянии заболевания (ремиссия или прогресс) и об эффективности назначенного пациенту лечения уже на первой неделе после его начала. Для прохождения проверки требуется направление врача.
источник
Жидкая биопсия опухоли: за пределами классической гистологии
А. А. Ковалев, д. м. н., профессор, Запорожская медицинская академия последипломного образования
Низкая эффективность эмпирической терапии рака обусловлена не только его клональной гетерогенностью, но и биологическими отличиями всех участников метастатического каскада. Эти отличия могут проявляться на геномном, эпигеномном и транскриптомном уровнях. Генетическое разнообразие раковых клеток и неудовлетворенность результатами лечения привели к появлению новой терапевтической концепции — индивидуализации лечения, основанной на молекулярном профилировании опухолевой ткани.
Поскольку биология опухоли в процессе лечения постоянно меняется, реализация концепции персонифицированной терапии потребовала новых методов диагностики с целью динамичного контроля болезни. Использования архивного материала биопсии первичной опухоли для этого явно недостаточно, а выполнение повторных биопсий новых висцеральных метастазов при опухолевой прогрессии может быть связано с риском для пациента. Кроме того, следует признать, что биопсия одного участка опухоли не отражает всей сложности ее геномного ландшафта, причиной которого является внутриопухолевая генетическая дивергенция.
Сегодня злокачественную опухоль принято рассматривать как сложную биологическую экосистему, в которой даже незначительные субпопуляции клеток могут усиливать гетерогенность и влиять на рост всей опухоли. В связи с этим интерес вызывает особая фракция циркулирующих в системном кровотоке опухолевых клеток, поскольку именно они ответственны за метастатическую прогрессию.
В экспериментальных моделях было установлено, что ежедневно из 1 г опухолевой ткани в циркуляцию поступает более 1 млн клеток. Однако опухоль выделяет в кровь не только клетки, но и собственные бесклеточные компоненты — циркулирующую опухолевую ДНК, матричную РНК, микроРНК, экзосомы, нуклеосомы, протеины и метаболиты. Одна опухолевая клетка способна выделять в кровь 1 пикограмм (10 -12 г) белковых продуктов своей жизнедеятельности в концентрации 200 нг/мл.
Циркулирующие в крови клеточные и бесклеточные компоненты злокачественной опухоли могут быть чувствительными диагностическими, прогностическими и предиктивными онкомаркерами, влияющими на принятие клинических решений. Особенно актуальной эта проблема является при проведении персонифицированного лечения у больных с первичной или приобретенной резистентностью.
Совершенствование методов молекулярной генетической визуализации привело к появлению нового направления диагностики рака, которое лежит далеко за пределами классической гистологии. Все больший интерес у клиницистов вызывает жидкая биопсия (liquid biopsy) — исследование периферической крови онкологического больного. Наиболее перспективными направлениями жидкой биопсии считают обнаружение и фенотипирование циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК), изучение молекулярного профиля циркулирующих ДНК и РНК, а также изучение внеклеточного опухолевого протеома и метаболома.
Циркулирующие опухолевые клетки
О наличии ЦОК при раке впервые сообщил T. R. Ashworth еще в 1869 г. (Aust. Med. J. 14, 146–149, 1869). Многочисленные попытки изучить эту фракцию опухолевых клеток долгое время были безуспешными из-за отсутствия соответствующих технологий их обнаружения в крови.
На протяжении двух последних десятилетий разработаны новые методики, которые позволили с высокой точностью, чувствительностью и специфичностью идентифицировать раковые клетки в системном кровотоке. Это существенно расширило наши знания о ранних и поздних стадиях канцерогенеза, а также позволило рассматривать ЦОК в качестве чувствительных прогностических, предиктивных и фармакодинамических онкомаркеров.
Причиной, которая заставляет раковые клетки мигрировать (метастазировать), является их внутриопухолевая конкуренция.
Раковые клетки развиваются в сложных условиях иммунного контроля, гипоксии и ацидоза. Во время дефицита ресурсов и постоянного давления внешней среды опухоль использует стратегию эволюционного компромисса — увеличивает скорость деления клеток, но производит при этом многочисленное и дефектное потомство, неспособное к конкуренции. Максимальная скорость роста численности за счет непрерывной рождаемости называется «r»-стратегией природного размножения живых организмов. Эта стратегия необходима для обеспечения численности вида в экстремальных условиях окружающей среды (E. Wilson).
Недифференцированная раковая клетка в условиях быстрой «r»-стратегии способна только «повторять, повторять, повторять». Для выживания клеток включаются соответствующие механизмы: отмена точек check-point в клеточном цикле, укорочение фазы G1, подавление репарации ДНК, метаболическое перепрограммирование (анаэробный гликолиз и ускоренная пролиферация даже в условиях ацидоза). Все это приводит к еще большему истощению ресурсов, поиску нового микроокружения и миграции.
Процесс метастазирования начинается с потери клетками эпителиальных и приобретения мезенхимальных антигенов (эпителиально-мезенхимальный переход), снижения адгезивных свойств, разрушения базальной мембраны и интравазации.
Эпителиальные клетки в кровотоке имеют короткую выживаемость — большинство из них погибают в течение нескольких минут, попадая в «капиллярную ловушку» и превращаясь в апоптотические тельца. Этому способствуют гемодинамический стресс и взаимодействие с клетками иммунной системы. Апоптотические тельца не могут реализоваться в виде гематогенных метастазов, но зато они являются источником циркулирующих опухолевых ДНК и РНК — важных участников метастатической прогрессии. Этот феномен описан ниже.
Выжившие немногочисленные ЦОК экспрессируют факторы, ингибирующие апоптоз и аноикоз (одна из форм апоптоза, когда смерть клетки наступает при нарушении адгезии и взаимоотношений с матриксом). Эти клетки изменяют свои гемодинамические и метаболические свойства и могут обнаруживаться в кровотоке как в виде единичных клеток, так и в виде циркулирующих опухолевых микроэмболов. Выжившие циркулирующие клетки обладают высоким метастатическим потенциалом.
Трафик ЦОК разнонаправленный. Эти клетки вначале попадают в преметастатическую нишу костного мозга, а затем, обогащенные цитокинами и факторами роста, мигрируют в периферическую нишу висцеральных органов, реализуясь со временем в гематогенные метастазы, или возвращаются в микроциркуляторное русло первичной опухоли, способствуя ее росту.
Методы идентификации ЦОК в крови
Сложности идентификации ЦОК состоят в том, что 1 опухолевая клетка окружена примерно 10 млн лейкоцитов и 5 млрд эритроцитов.
Для обогащения и детекции ЦОК используют их физические отличия от клеток крови (размер, плотность, электрический заряд) или же биологические особенности (экспрессию определенных мембранных рецепторов или цитозольных белков).
Поскольку опухолевые эпителиальные клетки имеют значительно больший размер, чем лейкоциты и эритроциты, они могут быть обнаружены с помощью микрофильтрации (используются полиуретановые фильтры с диаметром пор менее 30 мкм). Технология их выявления (которая используется также на кафедре онкологии ДЗ «ЗМАПО МОЗ Украины») включает такие этапы, как цитаферез с высоким коэффициентом центрифугирования, седиментацию, дезагрегацию клеток и лизис эритроцитов. После детекции ЦОК подвергаются цитологическим, цитоморфометрическим и иммуноцитохимическим исследованиям. На рисунках 1–4 представлены ЦОК различного фенотипа (исследования выполнены на кафедре онкологии ДЗ «ЗМАПО МЗ Украины»).
Для обнаружения ЦОК в периферической крови на основании их биологических характеристик чаще других используют маркер эпителиальной адгезии (EpCAM), для чего применяют различные коммерческие и экспериментальные технологии: CellSearch, MagSweeper, GILUPI cell collector, CTC chip, Herringbone chip, AdnaTest, IsoFlux.
Клиническое значение ЦОК
ЦОК могут быть использованы в качестве прогностических и предиктивных биомаркеров, а также с целью скрининга, выявления минимальной остаточной опухолевой болезни и для мониторинга заболевания.
Управление по контролю за качеством продуктов питания и лекарственных средств США (FDA), Министерство здравоохранения и социальных служб США рекомендуют использовать подсчет количества ЦОК в качестве прогностического маркера при раке грудной железы (РГЖ), раке предстательной железы (РПЖ) и колоректальном раке (КРР). Прогноз заболевания определяют количеством клеток (от 3 до 8) в 7,5 мл периферической крови (золотым стандартом считается метод CellSearch ® ). У больных с немелкоклеточным раком легкого количество ЦОК может достигать 50 в 7,5 мл крови.
В процессе проведения химиотерапии или таргетной терапии в качестве фармакодинамических маркеров целесообразно использовать всю фракцию ЦОК или некоторые субпопуляции с определенными молекулярными характеристиками (экспрессию HER2, EGFR1, IGFR). Снижение фракции ЦОК может свидетельствовать об эффективности противоопухолевого лечения, повышение фракции ЦОК во время химиотерапии — о безуспешности этой линии и необходимости использовать другие препараты. Повышение количества ЦОК в процессе лечения ассоциируется с более короткой выживаемостью у больных РГЖ, РПЖ и КРР.
Анализ количества ЦОК позволяет идентифицировать тех пациентов, которые наиболее выиграют от проведения адъювантной терапии.
Получены обнадеживающие результаты об использовании молекулярного профилирования ЦОК в качестве предиктивных маркеров для персонифицированной терапии.
Примерами такого подхода являются изучение в ЦОК активирующих мутаций EGFR при немелкоклеточном раке легкого для терапии некоторыми ингибиторами тирозинкиназы или изучение в ЦОК мутаций EML4-ALK, при которых отмечается выраженный эффект от терапии ALK-ингибиторов.
Известно, что экспрессия HER2 при РГЖ в клетках первичной опухоли и метастазах может отличаться в 30–40 % случаев. Принято считать, что наличие экспрессии HER2 в ЦОК является основанием для проведения анти-Erb-терапии, даже в случаях HER2-негативной первичной опухоли.
Считается также оправданным проведение персонифицированной терапии, ориентированной на определение экспрессии рецепторов андрогенов в ЦОК при РПЖ.
Циркулирующая опухолевая ДНК
Впервые циркулирующую в крови ДНК обнаружили P. Mandel и P. Metais еще в 1948 г., однако это открытие не привлекало внимание онкологов вплоть до 1994 г.
Небольшое количество свободной внеклеточной ДНК в кровотоке обнаруживают в физиологических условиях у здоровых людей, а также при доброкачественных опухолях, травме и воспалении. При раке и во время опухолевой прогрессии количество циркулирующей ДНК в крови резко возрастает. В этих случаях пул циркулирующей ДНК представлен опухолевым и неопухолевым компонентами.
Высвобождение фрагментов ДНК в циркуляцию происходит при некрозе, апоптозе и во время секреции опухолевых клеток. Источником циркулирующей ДНК при раке может быть первичная опухоль, метастазы, а также ЦОК и микрометастатические колонии клеток в костном мозге и висцеральных органах.
Установлено, что из опухоли массой 100 г (3×10 10 клеток) ежедневно в кровь поступает 3,3 % всей опухолевой ДНК. В среднем размер опухолевой ДНК варьирует от небольших (70–200 пар оснований) до крупных фрагментов (21 000 пар оснований), достигая концентрации 1000 нг/мл (у здоровых субъектов средняя концентрация циркулирующей ДНК составляет 30 нг/мл).
Циркулирующие нуклеиновые кислоты имеют период полураспада от 15 минут до нескольких часов. Двухцепочечные фрагменты ДНК живут дольше; вирусная ДНК, имеющая замкнутое кольцо, может прожить в кровотоке дольше линейной ДНК; микроРНК обладает высокой стабильностью.
Механизм удаления ДНК из циркуляции до конца не ясен. Разрушение внеклеточной ДНК происходит системой ДНКаз, а элиминация продуктов деградации осуществляется через печень и почки.
Получены интересные свидетельства о возможной интеграции внеклеточной циркулирующей ДНК в геном здоровых клеток-реципиентов. Этот феномен лег в основу геннометастатической теории опухолевой прогрессии, описывающей злокачественную трансформацию здоровых клеток отдаленных органов за счет горизонтального переноса (трансфекции) доминирующих онкогенов бесклеточной ДНК первичной опухоли в клетки преметастатической ниши. Возможно, что впоследствии именно эти клетки реализуются в виде гематогенных метастазов.
При опухолях различных гистогенетических подтипов пул циркулирующих нуклеиновых кислот состоит из эпигеномной, геномной, митохондриальной и вирусной ДНК.
Поскольку опухоли представлены смесью различных клонов злокачественных и доброкачественных клеток, в кровотоке может появляться ДНК как дикого (нормального), так и мутантного типа. Одна и та же опухоль может выделять в кровоток различные ДНК. В них могут быть обнаружены как генетические (мутации, делеции, амплификации), так и эпигенетические события (метилирование, микросателлитная нестабильность).
Для отделения из общего пула циркулирующей ДНК именно опухолевых нуклеиновых кислот требуется изучение характерных опухольспецифических генных мутаций, являющихся доказательством принадлежности ДНК и РНК к клеткам первичной опухоли. Следует учитывать, что характерные опухольассоциированные мутации и другие генетические аберрации в небольших количествах могут встречаться и у здоровых лиц при отсутствии рака (в частности у курильщиков).
При опухолях, зависимых от вирусного канцерогенеза (раке носоглотки, полости рта, шейки матки; гепатоцеллюлярной карциноме; лимфомах) в крови онкологических больных обнаруживается циркулирующая вирусная ДНК (ВПЧ, вирус Эпштейна–Барр, вирус гепатита В).
Одна соматическая клетка содержит в среднем 500 митохондрий и постоянное количество митохондриальной ДНК. Повышение числа копий и мутаций генов в митохондриальной ДНК в крови легко обнаружить. Обычно эти мутации ассоциированы с раком ободочной кишки, мочевого пузыря, опухолей головы-шеи, легких, грудной железы, почек и яичек. Фрагменты ДНК циркулируют в кровотоке в виде нуклеосом.
Нуклеосомы
Нуклеосома состоит из структурной части хромосомы и некоторых гистоновых белков, «упакованных» совместно в микропузырек фрагментом клеточной мембраны. Именно благодаря нуклеосомам опухолевая ДНК сохраняет в кровотоке все особенности ядерного хроматина клеток первичной опухоли.
Само по себе повышение концентрации нуклеосом в крови не является признаком злокачественности, так как часто встречается и при доброкачественных опухолях.
Поступление нуклеосом в кровоток в большом количестве происходит во время массивного апоптоза раковых клеток, что наблюдается в больших и быстро пролиферирующих опухолях, а также после химиотерапии.
Доказано, что в процессе проведения цитотоксической химиотерапии мониторинг концентрации нуклеосом в крови является ранним и чувствительным тестом эффективности лечения.
Доказана также диагностическая и прогностическая полезность выявления циркулирующей ДНК некоторых вирусов при раке соответствующей локализации (исследования проведены в Гонконге, Тайване и Китае, где вирусассоциированные опухоли являются превалирующими).
Циркулирующая матричная РНК и микроРНК
Кроме циркулирующей опухолевой ДНК, в сыворотке и плазме крови онкологических больных обнаруживаются матричные РНК и микроРНК, которые, наряду с ДНК и белками, являются основными внутриклеточными макромолекулами.
Впервые микроРНК (класс небольших некодирующих молекул РНК) были обнаружены в 2008 г. в сыворотке крови больного крупноклеточной В-клеточной лимфомой.
Зрелые микроРНК состоят из 19–25 нуклеотидов. 50 % всех человеческих микроРНК локализованы в участках хромосом, в которых обнаруживаются делеции и транслокации.
В целом микроРНК играют важную роль в регуляции экспрессии генов в раковых клетках. На примерах рака легкого, рака яичника, РГЖ, КРР доказано, что микроРНК участвуют в регуляции различных клеточных процессов, таких как апоптоз, пролиферация, эпителиально-мезенхимальный переход и метастазирование.
Несмотря на большое количество расщепляющих ферментов, циркулирующая РНК очень стабильна, поскольку «упакована» в экзосому.
Экзосомы
Экзосомы — это микроскопические (30–100 нанометров) внеклеточные везикулы, выделяемые в межклеточное пространство раковыми (и не только) клетками. Мембрана экзосом образуется в результате впячивания внутрь эндосомальной мембраны, а полость экзосом представлена частью цитоплазмы клетки. Кроме РНК в полости экзосомы находятся белки, липиды и ДНК. В одном микролитре плазмы крови человека содержится до 3 млн экзосом.
Основными функциями экзосом являются осуществление межклеточной коммуникации, горизонтальная передача генетического фенотипа, участие в неклассической секреции белков. Появляются новые данные об участии экзосом в развитии и метастатической прогрессии злокачественных опухолей.
Обнаружение и идентификация циркулирующей ДНК и РНК могут иметь важное научное и клиническое значение. Для обнаружения опухольассоциированных мутаций во фрагментах циркулирующей ДНК и мРНК используют такие методики, как секвенирование нового поколения (NGS), полимеразную цепную реакцию (PCR), MAP (MIDI-Activated Pyrophosphorolysis), масс-спектрометрию. Чувствительность этих методов очень высока, хотя повсеместное их использование в клинике ограничено стоимостью и техническими трудностями внедрения молекулярных методик в рутинную практику врачей-онкологов.
Циркулирующая ДНК как клинический онкомаркер
Определение циркулирующей опухолевой ДНК имеет прогностическое и предиктивное значение, а также позволяет предсказать рецидив заболевания и развитие резистентности во время проведения противоопухолевой терапии.
Несмотря на то что процесс изучения роли циркулирующих микроРНК в метастатической прогрессии только начался, уже сегодня можно сделать заключение о перспективности такого подхода в контексте появления нового биологического онкомаркера.
Прогноз и риск рецидива
У больных с резектабельными опухолями после потенциально радикального лечения с помощью молекулярного анализа циркулирующей ДНК можно с высокой вероятностью диагностировать минимальную остаточную опухолевую болезнь, выявить опухоль покоя и предсказать риск рецидива.
Наличие опухоли покоя является характерной чертой большинства видов рака. Эти спящие клетки (непролиферирующие микрометастазы) невозможно обнаружить стандартными методами радиологической визуализации. Присутствие в крови циркулирующей опухолевой ДНК указывает (при отсутствии видимых маркерных очагов) на наличие невидимых раковых клеток. Установлено, что после условно радикальной резекции специфические генетические аберрации в виде циркулирующей опухолевой ДНК сохраняются в крови до 12 лет. Если учесть, что период выведения ДНК из кровотока составляет в среднем 30 мин, можно сделать вывод, что наличие ДНК в крови отражает факт наличия минимальной остаточной опухолевой болезни в виде дремлющих микрометастазов в периферической нише. Именно во время некроза, апоптоза и секреции дремлющих опухолевых клеток их ДНК попадает в кровоток. Следует отметить, что сегодня нет ни одного клинического и радиологического метода, кроме определения циркулирующей ДНК, позволяющего подтвердить факт наличия опухоли истинного покоя — непролиферирующих микрометастазов в периферической нише.
По имеющимся данным, послеоперационный мониторинг опухольспецифических аберраций (АРС, ТР53, KRAS) в плазме больных с КРР позволяет прогнозировать рецидив заболевания в 100 % случаев. Эти генетические события наблюдаются у всех больных с остаточной опухолью.
При поздних стадиях и неоперабельном раке проведение количественной оценки уровня нескольких опухольассоциированных генетических мутаций, присутствующих в циркулирующей ДНК, является более чувствительным прогностическим маркером, чем определение отдельных специфических генетических аберраций в тканях опухоли.
Предиктивные маркеры и резистентность
При проведении персонифицированной терапии рака с использованием таргетных препаратов сегодня ориентируются на наличие предиктивных молекулярных маркеров, присутствующих в тканях первичной опухоли (HER2, EGFR, KRAS, BRAF, ALK, KIT, PDGFR).
Однако известно, что однократная биопсия и молекулярное профилирование первичной опухоли не позволяют полностью изучить генетический ландшафт опухолевой ткани во время прогрессии.
При позднем рецидиве архивные образцы тканей не могут быть использованы для принятия клинических решений. В такой ситуации следует выполнить повторную биопсию нового, быстро растущего метастаза.
Однако сегодня существуют неоспоримые доказательства того, что в качестве предсказания ответа на терапию более чувствительными являются предиктивные онкомаркеры, изученные в ЦОК и в циркулирующей опухолевой ДНК.
Исследования показали, что генетические аберрации в крови, ассоциированные с наличием резистентных клонов клеток в опухоли (метастазах), позволяют предсказать устойчивость к терапии на 10 мес раньше, чем появятся клинические и радиологические признаки резистентности (Recist).
Оценка генетического ландшафта опухоли
В отличие от биопсии тканей, жидкая биопсия опухоли позволяет представить всю панораму молекулярных событий и генетических мутаций, полученную из всех участков опухоли (первичная локализация, метастазы, ЦОК, опухоль покоя), а не из ее отдельного участка.
Кроме того, проведение повторных жидких биопсий, не представляя клинической проблемы, позволяет оценивать клональную эволюцию опухоли под давлением таргетной терапии.
Примером такого подхода является анализ генетической дивергенции у пациентов с BRAF V600E мутантной меланомой в процессе терапии вемурафенибом. Многократными периодическими исследованиями мутаций в циркулирующей опухолевой ДНК во время прогрессии были обнаружены несколько механизмов приобретенной резистентности: гиперэкспрессия MAP3K8, активация пути МАРК, усиление активности PDGFRβ, появление BRAF truncated, амплификация или мутация NRAS Q61K.
Скрининг панели соматических мутаций в циркулирующей опухолевой ДНК дает возможность идентифицировать редкие мутации (например, мутации в KIT при РГЖ, которые происходят в 1 % случаев, позволяют проводить эффективное, хотя и нестандартное лечение таких больных).
ЦОК и циркулирующая ДНК как дополняющие биомаркеры
Прогресс в области молекулярной биологии, в частности совершенствование методов секвенирования ДНК, вызвал дискуссию о том, какие циркулирующие онкомаркеры периферической крови являются более предпочтительными в клинике — ЦОК или ДНК.
Было проведено прямое сравнение (head tо head) циркулирующих онкомаркеров у 30 больных РГЖ с соматическими мутациями PIK3CA и TP53. Циркулирующая ДНК с подобными молекулярными аберрациями была выявлена у 97 %, ЦОК — у 87 % больных. При прогрессировании заболевания повышение уровня ДНК в крови наблюдалось у всех больных, в среднем за 5 мес до констатации клинической и радиологической прогрессии. Повышение количества ЦОК во время прогрессии наблюдали менее чем у 40 % больных. Сделан вывод, что оба сывороточных маркера (ЦОК и ДНК) коррелируют с ответом на лечение и прогнозом, однако циркулирующая опухолевая ДНК демонстрирует более широкий динамический диапазон с точки зрения фармакодинамического мониторинга.
С одной стороны, изучение мутационного пейзажа циркулирующей опухолевой ДНК имеет преимущества — простота и чувствительность современных методик. С другой стороны, методы идентификации ЦОК в периферической крови постоянно совершенствуются. Современные платформы позволяют не только облегчить процедуру поиска и обогащения клеток, но и предоставить дополнительную информацию в виде оценки морфологии клеток, их фенотипа; дают возможность устанавливать наличие множественных мутаций в одной клетке и в целом изучать индивидуальную эволюцию злокачественного клона. Современные технологии позволяют также объединить анализ мутаций генов с профилированием мРНК.
Таким образом, на практике циркулирующая ДНК является более предпочтительной для изучения мутаций, а ЦОК обеспечивает возможность изучить особенности биологии метастатической прогрессии и выявить новые функциональные мишени для таргетной терапии, особенно у больных, резистентных к проводимой терапии. Сочетание обоих маркеров является предпочтительным.
Заключение
Оценка прогноза заболевания у онкологического пациента основана на клиническом стадировании, а также на гистологической и молекулярной характеристиках первичной опухоли. При развитии резистентности к терапии каждому пациенту показано выполнение повторной биопсии с молекулярным профилированием тканей новых опухолевых очагов. Тактика, базирующаяся на анализе генетических изменений в клетках во время прогрессии, позволяет осуществлять лечение на основании принципов персонифицированной терапии.
Проведение повторных инвазивных биопсий висцеральных метастазов не всегда выполнимо в клинических условиях из-за риска для пациентов. К тому же молекулярный анализ тканей из одного участка опухоли не отражает всей ее генетической гетерогенности.
Процесс метастазирования проявляется выделением в кровь большого количества ЦОК и бесклеточных опухолевых компонентов (ДНК, мРНК, экзосом, нуклеосом, белков и метаболитов), которые сегодня расцениваются как высокочувствительные ранние диагностические, прогностические, предиктивные и фармакодинамические онкомаркеры.
Доступность биологического материала, широкие возможности современных методов молекулярной визуализации позволяют рассматривать жидкую биопсию опухоли (обнаружение и фенотипирование ЦОК, а также выявление мутаций в циркулирующей ДНК) в качестве обязательного рутинного теста клинической онкологии.
Перспективным является поиск новых белковых сывороточных онкомаркеров и циркулирующих метаболитов опухолевых клеток.
источник
Анализ крови на циркулирующие опухолевые клетки
ЦОК – циркулирующие опухолевые клетки.
Общеизвестно, что тактика лечения РМЖ, как и любого другого онкологического процесса, определяется степенью распространенности опухолевого процесса, т.е. стадией заболевания. Стандартными клиническими показателями являются размер первичной опухоли, состояние регионарных лимфатических узлов и наличие или отсутствие отдаленных метастазов. Однако, по данным литературы приблизительно 25 % пациенток с первично локализованным РМЖ без поражения регионарных лимфоузлов выявляются отдаленные метастазы после успешно проведенного лечения. Тогда как почти 30 % больных с первоначальными метастазами в подмышечные лимфоузлы наблюдаются без признаков рецидива заболевания в течение 5–10 лет [11; 7]. Таким образом, для назначения адекватной терапии рака молочной железы на различных стадиях заболевания и на разных этапах лечения, в том числе после удаления основной опухоли, необходим анализ, который позволил бы выявить единичные циркулирующие в крови опухолевые клетки.
Технология анализа в системе Cell Search™ основана на иммуномагнитном обогащении клеток при помощи металлических наночастиц, покрытых полимерным слоем, содержащим антитела к EpCAM молекулам (маркеры эпителиальных клеток), и иммунофлуоресцентной идентификации собранных в магнитном поле клеток. Процесс анализа состоит из нескольких этапов. Первый этап проводится на системе пробоподготовки – CellTracks®AutoPrep®. Максимальная разрешающая способность системы – детекция одной клетки в 7,5 мл крови. Уникальность предлагаемой технологии состоит в том, что система не только детализирует результаты мониторинга пациентов с метастазирующими формами рака без каких-либо инвазивных и болезненных процедур (все тесты проводятся на цельной крови), что позволяет проводить такие тесты регулярно, определяет генетические и фенотипические изменения опухоли, но и делает возможным количественную оценку единичных метастазных клеток после того, как основная опухоль была удалена.
Определение ЦОК является новым независимым прогностическим фактором прогноза РМЖ [3; 6; 10]. Прогностическая ценность выявления ЦОК была подтверждена в ряде исследований [5; 15]. Особо значимая корреляция с прогнозом заболевания была отмечена при РМЖ [12; 13]. При этом проведенные исследования показали информативность метода как при метастатическом РМЖ [4] так и при неметастатическом [9]. При этом частота выявления ЦОК у больных РМЖ без отдаленных метастазов колеблется от 10 до 60 % при различных методиках Cell Search (Veridex, Raritan, NJ) [2; 13; 14], и даже при ранних РМЖ (Т1-Т2) составляет 31 % [8]. Несмотря на то, что диагностически значимым уровнем является 5 клеток на 7,5 мл, проведенные исследования показали, что наличие даже одной ЦОК ухудшает показатели бессобытийной и общей выживаемости больных неметастатическим РМЖ. Более того, показано, что увеличение количества ЦОК до 3 клеток и более прогрессивно ухудшает эти показатели. При этом никакой корреляции количества ЦОК с поражением подкрыльцовых лимфоузлов выявлено не было [9]. Собственные исследования показали, что по всей вероятности при начальных стадиях заболевания порог позитивности определения циркулирующих опухолевых клеток, в частности при раке молочной железы, может быть снижен до 3–4 клеток, что в дальнейшем может служить маркером опухолевой прогрессии и потребует более тщательного наблюдения больных [1].
Материалы и методы исследования
В исследование были включены 13 пациенток, получавших лечение в ФГБУ «РНИОИ» Минздрава РФ по поводу верифицированного рака молочной железы различных стадий. У 11 пациенток анализ выполнялся на этапе оперативного лечения (IIa-IIIa стадии). Этим больным анализ выполнялся дважды: до операции и на первые сутки после. У других 2 пациенток детекция ЦОК проводилась однократно до начала неоадъювантной полихимиотерапии после проведенного нерадикального хирургического лечения в других медицинских учреждениях. Отсутствие отдаленных метастазов у всех пациенток, которым выполнялось исследование, подтверждалось при СРКТ органов грудной клетки, брюшной полости, малого таза и головного мозга. Все исследования выполнялись после письменного согласия больных на передачу биологического материала и обработку персональных данных. Кровь в объёме 8–10 мл забиралась в пробирки СellSave Preservative Tube, содержащие антикоагулянт ЭДТА, а также реагент для сохранения жизнеспособности опухолевых клеток. Для отделения клеток крови и опухолевых от плазмы кровь смешивалась с рабочим буфером из набора реагентов CellSearch® СТС kit и центрифугировалась при ускорении 800g в течение 10 минут. После этого образцы переносились в аппарат CellTracks® AutoPrep® System, который в автоматическом режиме, удаляя плазму крови и форменные элементы, иммуномагнитно обогащал образец микрочастицами железа, покрытыми антителами к маркёрам адгезии эпителиальных клеток EpCAM, CD45 и цитокератинам 8, 18, 19. Качество работы системы оценивали с использованием стандартного контроля СТС control kit. Материал сканировался в анализаторе CellTracks® Analyzer II®. С учетом морфологических характеристик и экспрессии маркеров регистрировались циркулирующие опухолевые клетки. Общее число выявленных опухолевых клеток являлось конечным результатом.
Результаты исследования и их обсуждение
Среди пациенток, у которых детекция ЦОК определялась на этапе хирургического лечения, у 8 женщин степень распространенности заболевания соответствовала стадии T2N0M0, у 1 – стадии T2N1M0 и у 2 – стадии T2N2M0. Кроме одной пациентки с центральным расположением опухоли у всех больных локализация – верхне-наружный квадрант. До операции у двух больных выявлены ЦОК, что составило 18,1 % от общего числа. Обе пациентки имели стадию T2N0M0 (IIa), в возрасте 66 и 73 лет находились в постменопаузе и локализацию опухоли в верхне-наружном квадранте. У одной пациентки была инфильтрирующая карцинома, а у другой сочетание инфильтрирующей карциномы и тубулярного рака. При этом, если у одной пациентки уровень ЦОК – 1 клетка оставался таковым и после операции, то у второй он увеличился с 2 клеток до 4. У обеих пациенток, которым детекция ЦОК проводилась до начала неоадъювантной полихимиотерапии после нерадикального оперативного лечения, первоначальная локализация опухоли была на границе наружных квадрантов и гистологическая структура соответствовала инфильтрирующей карциноме. Одна пациентка 34 лет имела стадию заболевания IIa, T2N0M0, тройной негативный рак. У нее определялось 2 ЦОК. У второй больной 49 лет, находящейся в перименопаузе и имеющей стадию заболевания T3N2M0 определялись 3 ЦОК.
Несмотря на небольшое количество наблюдений, наше исследование показывает, что ЦОК могут определяться у больных РМЖ и не имеющих признаков генерализации. Полученные нами результаты согласуются с заявленными ранее в литературе. Интересным, на наш взгляд, является повышение уровня ЦОК у одной больной через сутки после операции по сравнению с исходным уровнем. Это подтверждает тот факт, что операция сама по себе может способствовать выбросу опухолевых клеток в кровеносное русло. Об этом же свидетельствует и обнаружение ЦОК у больных после нерадикально выполненных оперативных вмешательств. Конечно, необходимы дальнейшие исследования, которые бы показали прогностическую значимость повышения уровня ЦОК после операции. Возможно, что именно факт детекции ЦОК у этих пациенток будет играть важную роль для выбора тактики дальнейшего лечения.
Каймакчи О.Ю., д.м.н., ассистент кафедры онкологии Ростовского государственного медицинского университета, г. Ростов-на-Дону;
Шихлярова А.И., д.б.н., профессор, главный научный сотрудник Южного научного центра РАН, г. Ростов-на-Дону.
источник